1987 wurden im Genom von Escherichia Coli-Bakterien kurze, sich wiederholende DNA-Abschnitte entdeckt, die von variablen Regionen unterbrochen wurden. Die Funktion dieser Elemente war damals noch unbekannt. 2002 wurde erstmalig der Begriff „Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats“, kurz CRISPR, für diese Elemente verwendet. Im Jahr 2007 fand Rodolphe Barrangou zusammen mit seinen Kollegen von der Firma Danisco, Madison, USA, dass die CRISPR-Sequenzen bei Bakterien der Abwehr von Infektionen mit Viren dienen. Dazu bauen die Bakterien Teile der Fremd-DNA als kurze Zwischenstücke in die CRISPR-Bereiche ihres Genoms ein. 2012 hat die Arbeitsgruppe um Emanuelle Charpentier und Jennifer Doudna dann die Funktionsweise dieses Abwehrsystems aufgeklärt. Die nach Erstinfektion eingebauten Teile der Virus-DNA werden in kleine RNA-Stücke, sogenannte cr-RNAs abgelesen. Diese cr-RNAs werden dann von Proteinen des Cas-Systems gebunden. Cas steht für CRISPR-assoziierte Sequenzen. Die kodierende DNA für diese Cas-Proteine ist nahe an der CRISPR-Genregion lokalisiert. Wenn diese kurzen cr-RNA-Stücke an Cas Proteine assoziieren, können sie im Bakterium sehr effizient Viren abwehren. Die Nukleinsäure des Virus wird durch die cr-RNA erkannt, und das assoziierte Cas-Enzym spaltet dann die virale DNA oder RNA. Über die CRISPR Region wird also ein Gedächtnis an den Virus gebildet, das auch dann nicht verloren geht, wenn sich die Bakterien teilen. Die crRNA, zusammen mit den Nucleasen des Cas Systems können dann virale Nucleinsäure schnell und zuverlässig erkennen und inaktivieren.
Schon ein Jahr nach der Veröffentlichung der Arbeitsgruppe um Emanuelle Charpentier und Jennifer Doudna im Juni 2012 folgten bis Sommer 2013 mehrere Dutzend Arbeiten in allen großen wissenschaftlichen Zeitschriften, die zeigten, dass diese Methode auch angewandt werden kann, um DNA in eukaryotischen Zellen zu verändern, z. B. Zellen der Maus oder DNA in menschlichen Zellen. Der erste Bericht stammte aus der Arbeitsgruppe von Feng Zhang vom Broad Institut am MIT im Februar 2013. Für die Anwendung bei Zellen der Maus oder des Menschen musste die kurze komplementäre cr-RNA so modifiziert werden, dass sie entsprechende Zielgene in eukaryotischen Zellen erkennt. Durch den Austausch der cr-RNA gegen eine künstlich hergestellte RNA jeglicher Sequenz können alle erdenklichen Zielsequenzen angesteuert werden, daher der Name „guide RNA, abgekürzt gRNA“, also einer kurzen komplementären RNA Sequenz, die relativ einfach hergestellt werden kann, und die die Cas-9-Nuklease zur potenziellen Schnittstelle im Genom der Zelle führt.
In einer solchen Zielsequenz wird der DNA Strang durch das Cas-9 Enzym gespalten, und man kann in den darauf folgenden Reparaturprozess eingreifen, indem man entweder ein neues DNA-Stück einbaut oder eine Mutation erzeugt. Diese nicht homologe Verknüpfung der DNA-Enden wird häufig benutzt, um im Labor in kultivierten Zellen Gene zu modifizieren, die für Krebsentstehung, für neurodegenerative Erkrankungen und andere wichtige medizinische Fragestellungen relevant sind. Sie wird auch benutzt, um genetisch modifizierte Modellorganismen herzustellen, zum Beispiel veränderte Fruchtfliegen, Mäuse, sogar genetisch veränderte Rhesusaffen. Nicht nur im biomedizinischen Sektor ist die Zahl der Publikationen zu CRISPR/Cas-9 in den letzten Jahren exponentiell gestiegen, ebenso die Zahl der Anwendungen und Patente aus den Bereichen Pflanzenforschung, Medikamentenproduktion und anderen technischen Anwendungsbereichen wie zum Beispiel der Entwicklung einer Xylose (Holzzucker-) abbauenden Hefe mit dem Ziel der Biotreibstoffproduktion.
Mit einer solchen potenten Technik sind natürlich auch Probleme verbunden. Eine chinesische Arbeitsgruppe um Junjiu Huang, Sun Yat-sen Universität Guangzhou, hat im April letzten Jahres berichtet, sie hätte die CRISPR/Cas-9-Technik angewandt, um bei menschlichen Embryonen zu testen, ob das Gen für Betaglobin modifiziert werden kann, das bei der Thalassämie, einer in südlichen Ländern weit verbreiteten Blutkrankheit, mutiert ist. Die Arbeit wurde in der Zeitschrift Protein Cell publiziert (Protein Cell 6: 363-372, 2015), deren Büro in Peking liegt. Sie war zuvor bei den weltweit führenden Wissenschaftsmagazinen Nature und Science eingereicht worden, dort aber nicht publiziert worden. In verschiedenen Blogs und Stellungnahmen von Wissenschaftlern wurde das begrüßt: 1. Der Erkenntniswert der Arbeit sei zu gering, die dort gezeigten Ergebnisse hätte man aufgrund bereits bekannter Ergebnisse vorhersagen können, 2. die CRISPR/Cas-9-Technik in dieser Studie sei nicht auf dem neuesten Stand gewesen, 3. die Ergebnisse hätten keine praktische Bedeutung für eine Umsetzung, und darüber hinaus sei das Experiment ethisch problematisch.
Dem letzten Punkt haben die Autoren widersprochen. Sie hätten tripronukleäre Zygoten verwendet, die ohnehin kein Entwicklungspotenzial haben. Diese tripronukleären Zygoten wären in den chinesischen Kliniken für Reproduktionsmedizin, in denen sie gesammelt wurden, ohnehin vernichtet worden. Tripronukleäre Zygoten entstehen, wenn eine weibliche Eizelle nicht nur von einem Spermium, sondern von zwei Spermien gleichzeitig befruchtet wird, so dass der durch Fusion entstehende Embryo nicht zwei, sondern drei halbe Chromosomensätze enthält. Tatsächlich kommt das bei der künstlichen Befruchtung in zwei bis fünf Prozent der Fälle vor. Die nach Fusion der drei Vorkerne entstehenden Embryonen entwickeln sich in der Regel nicht weiter, nur selten bis zur Blastozyste, und erreichen damit nicht das Stadium, in dem sie sich in die Gebärmutter einnisten.
Was haben die Forscher nun mit diesen tripronukleären Zygoten gefunden? Die CRISPR- gRNA für Betaglobin und Cas-9 wurde in 86 Embryonen injiziert. Nach 48 Stunden hatten 71 Embryonen überlebt, 54 konnten genetisch getestet werden. Nur bei 28 Embryonen hatte Cas-9 im Betaglobin-Gen geschnitten, die meisten dieser Embryonen zeigten nur Mosaikmuster: Die Cas-9-Nuklease hatte also nicht im befruchteten Einzell-Stadium, sondern erst in den nachkommenden Generationen der Zellen geschnitten. Ein sich theoretisch daraus entwickelnder Embryo hätte dann sowohl kranke als auch gesunde Zellen. Die modellhafte Reparatur des Betaglobin-Gens war nur in vier der 86 Fälle überhaupt nachweisbar. Darüber hinaus fand sich bei praktisch allen getesteten Embryonen eine hohe Zahl von off-target-Mutationen: Die gRNA hatte vermutlich unspezifisch an andere Bereiche des Genoms gebunden, dort die DNA geschnitten und verändert.
Die Reaktionen auf diesen Artikel waren vehement, nicht nur in der Wissenschaft, auch in der allgemeinen Presse. Wissenschaftliche Organisationen wie die Deutsche Forschungsgemeinschaft und die Nationale Akademie der Wissenschaften Leopoldina reagierten mit entsprechenden Stellungnahmen. Aber auch in anderen Ländern war dieser Bericht Anlass für sehr umfassende Stellungnahmen zur Ethik von Genome Editing, zum Beispiel durch das Nuffield Council on Bioethics in Großbritannien.
Auch andere Wissenschaftler meldeten sich zu Wort. So forderte der Nobelpreisträger David Baltimore zusammen mit einer Reihe prominenter Kollegen und Kolleginnen ein weltweites Verbot zur Anwendung von CRISPR/Cas-9 für die Modifikationen der menschlichen Keimbahn. Ähnlich war auch die Diskussion in der weltweiten Presse. Ein Zitat von Rudolf Jaenisch, einem weltweit führenden Molekularbiologen und Stammzellforscher am MIT in Harvard, USA, aus einem Artikel der New York Times bringt die Meinung vieler Wissenschaftler genau auf den Punkt, warum diese Studie zumindest aus wissenschaftlicher Sicht bedeutungslos ist:
“ A pressing question, said Rudolf Jaenisch, an M.I.T. biology professor, is why anyone would want to edit the genes of human embryos to prevent disease. Even in the most severe cases, involving diseases like Huntington’s in which a single copy of a mutated gene inherited from either parent is enough to cause the disease with 100 percent certainty, editing poses ethical problems. Because of the way genes are distributed in embryos, when one parent has the gene, only half of the parent’s embryos will inherit it. With gene editing, the cutting and pasting has to start immediately, in a fertilized egg, before it is possible to know if an embryo has the Huntington’s gene. That means half the embryos that were edited would have been normal — their DNA would have been forever altered for no reason. “It is unacceptable to mutate normal embryos,” Dr. Jaenisch said. “For me, that means there is no application.”
[Wenn man sich theoretisch die Anwendung von CRISPR/Cas-9 bei einer Erkrankung wie Morbus Huntington vorstellt, bei der im Alter von 30-40 Jahren jeder Mutationsträger mit praktisch 100 Prozent Wahrscheinlichkeit erkranken würde, ergäbe sich folgende Problematik: Von den Nachkommen wären nur 50 Prozent von diesem Gendefekt betroffen, und da man nicht weiß, welche Embryonen betroffen sind, würden unnötig 50 Prozent gesunde Embryonen mit CRISPR/Cas-9 behandelt. Und dann ist die Technik nicht so effizient, dass sie das Gen in allen Zellen rekombinieren und reparieren kann. Eine Anwendung macht unter diesen Umständen keinen Sinn und ist inakzeptabel. Deutscher Text: MS]
In Deutschland verbietet das Embryonenschutzgesetz von 1990 jede Forschung an Embryonen. Die publizierte Studie würde unter Paragraph 2 „Ebenso wird bestraft, wer zu einem anderen Zweck als der Herbeiführung einer Schwangerschaft bewirkt, dass sich ein menschlicher Embryo extrakorporal weiterentwickelt“ und Paragraph 5 des Embryonenschutzgesetzes fallen: „Wer die Erbinformation einer menschlichen Keimbahnzelle künstlich verändert, wird mit Freiheitsstrafe bis zu 5 Jahren bestraft.“ Die Anwendung der CRISPR Cas-9 Technik zur Veränderung der Keimbahn des Menschen wäre also in Deutschland verboten.
Im Gegensatz dazu wird die CRISPR/Cas-9-Technik außerhalb des Wirkbereichs des Embryonenschutzgesetzes mit hoher Wahrscheinlichkeit zu Anwendungen führen. Dazu drei Beispiele, wie diese Technik in verschiedene Anwendungsrichtungen weiterverfolgt werden kann.
- Anwendungen in der somatischen Gentherapie, also ein Einsatz der CRISPR/Cas-9-Technik, um Mutationen in erkrankten Zellen zu behandeln. Ziel der somatischen Gentherapie sind also nicht Keimbahnzellen, sondern beispielsweise Krebszellen oder von einer Krankheit betroffene Zellen, in denen eine defekte Genfunktion wiederhergestellt werden soll. Die genetische Veränderung ist also auf diese Zellen beschränkt und wird nicht an die Nachkommen weitergegeben.
- Anwendungen im Bereich der Landwirtschaft und der Biotechnologie.
- Anwendungen in „gene drive“-Verfahren, die man z.B. bei der Bekämpfung der Übertragung von Malaria durch Anopheles Mücken einsetzen könnte. Diese Anwendungen bedürfen am dringendsten einer Diskussion zur Ethik und zur Nutzen/Schaden-Abwägung.
Die Spinale Muskelatrophie ist ein gutes Beispiel für eine mögliche Anwendung im Bereich Somatische Gentherapie. Diese Erkrankung ist die häufigste Form einer neurodegenerativen Motoneuronerkrankung im Kindesalter. Weltweit ist eines von rund 5.000 Neugeborenen betroffen. Bei der schwersten Verlaufsform, die relativ häufig ist, führt die Erkrankung innerhalb von wenigen Jahren zum Tod. Die Kinder lernen nie zu sitzen oder zu laufen, sie sind zu schwach und sterben in der Regel an Infektionen und Atemlähmung, weil auch die Muskulatur für die Atmung betroffen ist.
Das Krankheitsgen wurde 1995 entdeckt. Fast 95 Prozent aller Erkrankungsfälle basieren auf einem Gendefekt im SMN-1-Gen. Die Erkrankung tritt auf, obwohl es beim Menschen auch ein 2. SMN Gen gibt, von dem das SMN-Protein gebildet werden könnte. Das zweite SMN-Gen beim Menschen unterscheidet sich nur in wenigen Nukleotiden. Davon ist nur ein Nukeotidaustausch relevant, der für den Unterschied zwischen dem SMN-1– und SMN-2-Gen sorgt, ein C->T-Basenaustausch. Dadurch wird eine splice acceptor site verändert, so dass 90 Prozent der mRNA-Kopien dieses Gens die von Exon-7 kodierten Sequenzen nicht enthalten. Das daraus resultierende Protein ist deshalb verkürzt und biologisch inaktiv. Nur 10 Prozent der Kopien sind vollständig, und diese reichen nicht, um die Entwicklung und Funktion von Motoneuronen aufrechtzuerhalten. Aus diesem Grund hat sich die Therapieentwicklung bei dieser Erkrankung seit 10 Jahren darauf konzentriert, kurze synthetische DNA-Stücke zu entwickeln, sogenannte Oligonukleotide, die inzwischen in klinischen Studien auf ihre Wirksamkeit hin getestet werden. Diese Oligonukleotide werden bei den betroffenen Kindern in das Rückenmarkwasser appliziert. Dort werden sie von motorischen Nervenzellen aufgenommen, gelangen in den Zellkern, und so wird nun diese Nukleotidaustauschstelle, die dafür verantwortlich ist, dass die von diesem Chromosomabschnitt Exon-7 kodierten Sequenzen übersehen werden, wieder erkannt, und es kann nun mehr funktionelles SMN Protein gebildet werden. Erste erfolgversprechende Ergebnisse gibt es bereits, und so ist es naheliegend, dass inzwischen offen darüber gesprochen wird, CRISPR/Cas-Ansätze für die Behandlung dieser Erkrankung zu entwickeln, mit denen dieser Basenaustausch im SMN2 Gen in den motorischen Nervenzellen nicht nur transient, sondern auf Dauer bewerkstelligt werden soll.
Im Vergleich zu einer Rekombination in frühen Embryonen lägen die Vorteile auf der Hand. Die Therapie wird erst dann begonnen, wenn auch die Krankheit als solche diagnostiziert wird. Ziel ist, die fortschreitende Degeneration der motorischen Nervenzellen aufzuhalten. Und selbst wenn es nicht gelingt, das SMN2 Gen in allen Motoneurone zu rekombinieren, wäre es möglich, bereits dann eine Verbesserung oder Verlangsamung der Erkrankung zu erreichen, wenn nur wenige motorische Nervenzellen funktionell wiederhergestellt würden. Auch hier gibt es Risiken wie z.B. unerwünschte off-target-Effekte, die die Zellen noch mehr schädigen könnten, oder unerwünschte Effekte in anderen Zellen, wenn es nicht gelingt, die Konstrukte ausschließlich nur in motorische Nervenzellen einzuschleusen oder nur dort zur Wirkung kommen zu lassen. Es ist aber vorstellbar, dass Betroffene und die Eltern betroffener Kinder diese Risiken in Kauf nehmen und sich mit Nachdruck für eine Anwendung aussprechen.
Weitere Anwendungen von CRISPR/Cas-9 zeichnen sich ab in der Biotechnologie und in der Pflanzenzucht. Im Juni 2015 wurde berichtet, wie mit der CRISPR/Cas-9-Technik Hefestämme so verändert werden können, dass sie aus Xylose Biotreibstoff herstellen. Denkbar sind weitere Entwicklungen bei Hefen und anderen Zellen für die Herstellung von Medikamenten und technischen Stoffen, aus denen zum Beispiel Energie gewonnen werden kann.
Eine weitere Entwicklung ist die Anwendung in der Pflanzenzucht. Als Beispiel ein Bericht aus dem Jahr 2014, wie durch gleichzeitige Mutation von drei Genen im Saatgut ein Mehltau-resistenter Weizen hergestellt werden konnte.
Auch die „gene-drive“-Methode beruht auf der CRISPR/Cas-9-Technik. Sie ist vor allem für einen Einsatz bei Infektionskrankheiten im Gespräch, die durch Insekten übertragen werden. Es war zwar bisher auch mit konventionellen Techniken möglich, das Genom von Insekten zu verändern. Es wurde auch schon angedacht, so z.B. genetisch mutierte Anopheles-Mücken herzustellen, die nicht mehr in der Lage sind, den Malaria-Erreger zu übertragen. Aber diese Mücken würden diese Eigenschaft nur auf die Hälfte ihrer Nachkommen übertragen, und das reicht nicht aus, um die Population nachhaltig zu verändern. Ganz anders, wenn das CRISPR/Cas-9-System einsetzt würde. Dazu müsste man die genetische Information für die gRNA und für Cas-9 im Genom der Mücke verankern: Die Rekombinase könnte dann auf beide Allele wirken, auch bei den Nachkommen. Die veränderte Eigenschaft würde so auf alle Nachkommen übertragen, die Mutation würde sich in der Gesamtpopulation der Mücken ausbreiten, und die mutanten Mücken wären nicht mehr in der Lage, den Malaria-Erreger zu übertragen.
Eine Reihe von Wissenschaftlern hat angemahnt, dass eine Debatte zu diesem Thema notwendig ist, um auf internationaler Ebene klare Regelungen zu schaffen, unter denen solche Eingriffe in die Umwelt erlaubt bzw. verboten werden. Das bedarf natürlich einer breit geführten öffentlichen und sachlichen Diskussion, die erst geführt werden muss.